Polymerase Chain Reaction (PCR)

  • Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metoda yang banyak digunakan untuk memperbanyak DNA yang akan dipakai pada kloning gen, deteksi polimorfisme, diagnosis penyakit, dan lain-lain.
  • Bahan awal untuk PCR adalah sejumlah DNA yang mengandung urutan yang ingin diperbanyak, dikenal dengan nama DNA template.
  • DNA template dapat diperoleh dengan berbagai cara di antaranya biopsi jaringan otot, sampel darah, dan sel folikel akar rambut.
  • Reaksi PCR merupakan tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yakni melalui proses pembukaan rantai DNA utas ganda (denaturasi), penempelan primer (annealing), dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari terminal 5′ ke 3′.
  • Bedanya dengan replikasi in vivo, teknik ini tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA.

Amplifikasi DNA

Dapat dilakukan secara:

  1. In vivo → dengan teknik rekayasa genetika/kloning dengan sel hidup → transforman
  2. In vitro → teknik kloning gen dalam tabung reaksi PCR

PCR (Polimerase Chain Reaction)

Syarat dalam tabung reaksi terdapat:

  1. Template (DNA yang telah diketahui urutannya)
  2. Primer (oligonukleotida, 15-20 pb)
  3. Enzim polimerase → termostabil

Prekursor nukleotida

PCR (Polimerase Chain Reaction)

  1. Templat

}  suatu segmen pada molekul DNA (hasil isolasi dari suatu sumber dan telah diketahui urutan basa nukleotidanya).

}  digunakan untuk menempelkan primer

  1. Primer

}  suatu oligonukleotida (15 -20 pb)

}  dapat disintesis dengan mesin

}  sebagai pemicu dalam pembuatan rantai DNA

}  primer ini diletakkan dengan posisi yang berlawanan terhadap rantai DNA yang akan diperbanyak

  1. DNA polimerase

}  enzim yang memiliki kemampuan menggabungkan nukleotida

}  mengkatalisis pembentukan DNA yang sedang tumbuh: diawali dari primer yang berjalan dari ujung 5’ ke arah 3’

}  dapat diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus

Proses PCR

}  Tahapan proses

  1. denaturasi dsDNA menjadi ssDNA (94 °C, 60”)
  2. annealing (55° C)
  3. sintesis (72 °C)

Satu siklus :

}  dimulai dari denaturasi, annealing sampai sintesis → 5 menit

}  proses polimerisasi satu molekul dsDNA menghasilkan 2 copy

Kegunaan PCR

  • Selain untuk amplifikasi dapat digunakan untuk menentukan apakah urutan-urutan  nukleotida suatu DNA mengalami mutasi.
  • Untuk bidang kedokteran forensik.
  • Untuk melacak asal-usul seseorang dengan membandingkan “finger print”.